十一长假结束，小编正式回归。zui近新闻也是目不暇接，前有国人屠呦呦获诺贝尔生理学和医学奖，后有AB教主的世纪婚礼。为了让还在倒时差的各位亲们能更好 的跟上时代的新步伐，小编特意整理了哥家9月 24日下午19:15 ~21:00由资深技术专家带来的“单克隆抗体药物纯化工艺探索与开发"精彩Q&A回顾。错过的亲们，让我们一起再次感受知识的力量吧！
1干货回答 让您分分钟了解抗体纯化工艺
什么是反压、压力降？
答疑解惑
“了解基本名词术语"
反压是层析过程中，泵产生流速，流速作用层析柱产生的压力。如下图所示：
| 层析柱的反压以及压力降 |  |
| 图为?KTA Avant 的压力显示 |
0.5MPa 为层析柱的反压，压力降为0.3MPa
层析柱产生反压：主要是层析介质，层析柱的设计，层析柱筛板等。真正影响层析介质的为压力降，压力降高于层析介质的耐压，层析介质会损坏。
层析填料入厂检验做哪些比较合适？
答疑解惑
“填料检验多重标准"
原料入厂GMP要求做检测，合格才能进厂使用。一般有几种方法：
审计供应商 | 做供应商审计是否复合ISO等要求，确认此供应商符合我项目要求，所以可以免检。 |
自己检测 | 此需要在工艺开发中做层析介质重要参数对产品质量的确定。（例如：层析介质的颗粒在XX-XXum时，产品的质量才能到达要求，并且供应商的产品不同批次 的颗粒有较大差别，所以确定颗粒为比检项目）。对于这个问题，国外药厂一般在工艺开发时，至少做3批不同批号的层析介质实验以确定供应商出厂指标范围内可 以满足要求。 |
Protein A和Protein G两种介质在纯化抗体有何区别，结合位点各有几个？
答疑解惑
“Protin A和G的区别结合位点"?
| Protein G 的结合位点 | Protein G与Ig G的Fc结合，同时也可以结合IgG CH1区域。此配基为 17KD， PI 4.1. 在全抗体或Fc融合蛋白的纯化中由于Protein A 层析介质的载量高于Protein G，所以一般使用Protein A层析介质。 |
| Protein A 的结合位点 | 与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。 |
| Protein A与抗体IgG 结合区域 | Protein A与抗体IgG 结合有两个区域,Fc 与Fab。主要与Fc的CH2,CH3 结合的是Protein A 的B，与Fab 结合位点是VH3 |
各环节中浓缩和换液采用膜包还是中空纤维，二者有什么区别？
答疑解惑
“用途区别"
中空纤维 | 中空纤维一般用于样品中含有沉淀、浑浊、颗粒等，以及低剪切力的样品 |
| 膜包 | 膜包用于样品比较干净的样品 |
“在工艺中区别"
中空纤维 | 用于低剪切力的病毒浓缩；固液分离；澄清；以及包涵体复性等 |
| 膜包 | 用于缓冲液更换，浓缩等 |
2、速问速答小问题大门道，好知识速速来袭
层析除病毒验证，
需要做旧胶的验证吗？
答疑解惑
关于病毒验证是否需要做旧胶还没有听到法规的要求。新药报批时一般要求工艺验证，在工艺验证中会涉及层析介质的寿命。层析介质寿命的确定是有效去除杂质达到质量要求。亲和层析/离子交换介质已经有文章证明Protein A在寿命内有*病毒去除。
非糖基化的抗体
采用什么技术来去除？
答疑解惑
非糖基化的抗体一般是抗体片段(CHO表达的为有糖基)，抗体片段一般使用Protein L吸附Fab
阴离子交换低电导较好，但zui近做了DOE，
发现电导11比较好，何解？
答疑解惑
阴离子交换一般采用流穿模式（FT），所以需要一定的电导率让抗体（单体）流穿，其他杂质吸附。不同的样品还是以实验为准
能否介绍一些FC-肽融合蛋白的精细纯化方法？
答疑解惑
FC-融合蛋白的的精细纯化一般采用阴/阳离子交换。也有使用HIC，或羟基磷灰石的纯化。还要根据样品做DOE。
柱高不变，直径由1.6cm放大到比如20cm，柱压会增大多少？
答疑解惑
层析放大的原理为直径放大，柱高不变（即线性流速或保留时间不变）。在放大时层析柱的分配器，以及筛板设计非常重要。设计优异的柱压一般不会增大。
工艺验证中需要确定CQA，CPP，可以针对一个层析方法说明一下确认的方法吗？
答疑解惑
首 先确定不同步骤主要去除杂质以及去除杂质能力，例如阳离子去除聚体步骤，经过此步骤聚体可以从2%降至0.3%。经过DOE实验确定，CPP： 为上样量（xx-xxmg/ml），样品电导率（~~），洗脱时的电导率范围。在以上的条件下可以满足CQA（0.3%以下）聚体的要求。
阴离子流穿模式，说的载量指的是目的蛋白载量？VH一个domain的纯化可以用Protein A亲和吗？
答疑解惑
阴离子流穿模式（FT）的载量指的是抗体的量。一般在上样是抗体流穿，检测纯度，HCP等，至超标时上样的抗体的量为载量
Protein A （重组的，非修饰的）与VH3结合
3、案例分享 ?用实验中的真实案例答疑解惑
有没有关于酸碱异构体组分降低的案例分享？
答疑解惑
对于酸碱异构体的分离一般比较困难，因为差异较小。在GE的应用文献中有使用Capto S ImpAct分离的。一般使用阳离子交换（颗粒小的30-40um），做线性梯度洗脱。也可以在DOE时设计盐梯度与改变pH同时的洗脱策略。
现在我做的抗体，proteinA 捕获时只要载量高就会出现浑浊，低载量澄清？
答疑解惑
| Protein A的层析介质 | 一般Protein A的层析介质载量在30-50g/l，洗脱时可以达到10-20mg/ml浓度，工程抗体的溶解度较高，一般较少出现沉淀。但是有时洗脱时由于HCP没有去除干净，洗脱液中会有沉淀，过夜或低pH后更明显 |
| 建议 | 检测抗体的溶解度，检测洗脱的HCP的量 |
| 此步骤可以使用低pH（pH在5-6，要实验），加入一些盐或低浓度尿素等 |
宿主DNA和宿主蛋白是否是同步去除的，宿主DNA如何更好去除？
答疑解惑
DNA/HCP一般会同步去除，只是不同步骤去除的量稍有不同。 对于DNA的去除，亲和/阳离子交换/HIC不吸附，阴离子交换吸附。只有实验才能确定您的项目哪种。
抗体的等电点能否用生物信息学的方法预测，消光系数怎么计算？
答疑解惑
一般预测的软件得到的一些参数不是很准确，不同的表达系统，不同的培养方法，所得到的等电点不同。所以只能参考。
| 消光系数的公式 | A=ECL，E消光系数，C浓度，L光径。使用纯的抗体样品标定消光系数。 |
| 小技巧 | 使用1mlHitrap MabSelect Sure纯化收集洗脱样品，使用Lowry或Bradford标定消光系数。在之后的工艺探索中可以简单的使用紫外吸收值定量。 |
