关于WB实验中的NC膜你知道多少？
点击次数：1253 更新时间：2023-11-24
首先了解下，体外诊断原料的NC和蛋白转移的NC是有区别的：体外诊断原料的NC膜是作为核心载体原料，孔径在10-15μm，带背衬。而蛋白转移的NC膜，一般用于WB实验，孔径0.22um和0.45um，不带背衬。
其次用在免疫印迹中最常规的膜的类型是硝酸纤维素膜（NC 膜）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜。两者主要区别：
| 产品 | Biotrace NT 膜 | FluoroTrans W PVDF 膜 |
| 推荐货号 | 66485 | BSP0161 |
| 描述 | 纯硝酸纤维素，0.22μm | 聚偏氟乙烯，0.2μm |
| 应用 | 蛋白转移 核酸检测 ELISA | 蛋白转移 蛋白点或条印迹 免疫染色检测 |
| 优势 | 高灵敏度 低背景 | 最高的灵敏度 低背景 低 burn through 高结合力 化学品抗性 高拉伸强度 |
| 结合反应 | 疏水和静电 | 疏水（甲醇浸泡） |
| 固定方法 | Western 转移点或条印迹 烤和紫外交联（用于核酸） | Western 转移点或条印迹 |
转印膜的免疫印迹常见问题分析与解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
| 没有阳性条带或很弱 | 抗体活性低或效价低 | 分装和在零下 20 度储存抗体溶液以及避免多次反复冻融。使用更高浓度的一抗。 |
| 转膜不充分（转膜后通过凝胶染色得到了确认） | 增加转膜的时间。降低转膜缓冲液中甲醇的浓度。 加入 0.1%的 SDS 能够帮助大蛋白的转膜。 | |
| 低的偶联活性 | 确保胶和膜之间没有气泡。使用不含 SDS 的转膜缓冲液。如果使用的是 Biotrace NT 膜，则需在转膜缓冲液中加入甲醇 | |
| 封闭剂干扰了抗体的结合 | 在 4 度储存偶联物。增加偶联物的浓度或孵育时间。 | |
| 背景高 | 使用一个不同的封闭剂。 | |
| 抗体和酶偶联的效果差 | 颜色反应时间太长 | 当需要的颜色深度达到之后立即停止反应 |
| 封闭不全 | 使用亲和纯化的二抗。 | |
| 封闭剂中存在磷酸酶或过氧化物酶的活性 | 增加封闭时间。使用一个不同的封闭剂。 | |
| 背景点状物 | 缓冲液中存在颗粒 | 试剂使用前用过滤器过滤。 |
| 假阳性或点状 | 一抗的交叉反应 | 进一步纯化或预吸附膜抗体。如果条件可以的话使用单抗。降低一抗的浓度。 |
| 样本中存在磷酸酶或过氧化物酶的活性（通过在检测中不加一抗和二抗得到确认） | 在封闭前通过 80 度 20 分钟加热来失活酶的活性。 |
