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侧向层析技术
点击次数:527 发布时间:2022-04-25

侧向层析技术介绍

1、侧向层析,也叫侧向流层析、侧流层析,在POCT技术中,应用最为广泛。侧向层析技术是20世纪90年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术,具有快速、简便、单人份检测、经济的优点,现已广泛应用于医学检测、食品质量监测、环境监测、农业和畜牧业、出入境检验检疫、法医定案等领域。

侧向层析技术以大孔径的微孔滤膜(NC膜、硝酸纤维素膜)为载体,将特异性的抗原或抗体固定在NC膜上,当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后,通过毛细作用侧向移动,与结合垫上的胶体金或微球标记的试剂发生特异的免疫反应,再移动到NC膜上,被固定在NC膜表面的抗原或抗体捕获,聚集在检测带上,通过目测硝酸纤维素表面标记物(胶体金或乳胶颗粒)的光反射信号的密度得到直观的显色结果。其它未结合的标记物则越过检测带,流入吸水垫中,达到自动分离的目的。


2、分类

按照检测物的类别划分,可以分为两大类,分为免疫层析和核酸层析,在免疫层析中又可分为抗体检测和其他检测(抗原、激素等)2个子类。

也有按照出结果的方式不同,分为定性和定量、半定量。

还有根据显色物或信号物质、标记物质不同分为:有色侧流层析、荧光侧流层析、磁信号侧流层析等。

很多人将POCT看成侧流层析,这是很大的误解,侧流层析是POCT技术中很小的一部分,以后会慢慢介绍的,是树木和森林的关系。


根据标记物的种类不同分类

标记物类型代表
有色纳米微球乳胶微球、胶体金、胶体碳、胶体硒

荧光材料

罗丹明、上转发光材料、镧系元素、量子点
磁性微球超顺磁性纳米微球

3、任何事物都有两面性,侧向层析技术也不例外

优点:一步检测,没有多余的清洗过程

          多通道、单通道可灵活选配,占用空间小

          快速、低成本、少的样本量

          无需机器也可判读定性和半定量的结果

          短的研发周期可快速投放市场产生利润

          很少的样本检测程序

          满足即时检测和床边检测

          可以检测物质种类繁多,包括蛋白、半抗原、核酸、扩增产物等

          较好的满足单人份检测和中等批量的检测量

          长的产品效期,不需要冰箱,可提前备货

          对于液体的样本,几乎不需要前处理或者仅需要离心

缺点:

          不精确的加样量减少准确度(滴管、毛细采血管等)

          人工操作步骤较多,存在误差

          样本的加样量少是限制敏感性的一个因素

          显示信号没有经过酶等二次放大

          结果判读采用比色卡或图形扫描、读条仪、CCD,存在影响

          对原材料抗体或抗原等要求较高

          分析时间取决于样本的性质和粘度

          膜的孔径结构,膜孔径大小有差异的阻碍,造成精密性差异

          非液体样本需要前处理          


4、侧向层析卡板的结构(以胶体金免疫层析(双抗体夹心法)为例)。

1.jpg

基本结构作用技术要求
样品垫

1.预处理样本,消除干扰因素

2.若检测全血样本,可以分离血清和血细胞(需加入滤血膜

1.特异性强,减少待测物质与样本垫之间的非特异性结合

结合物

释放垫

1.包被胶体金标记的抗体,保证其生物学活性

2.样本流过时,标记物释放并与待测物质结合

1.流动性好,能够使样本及胶体金标记物流入层析膜

2.标记物释放要充分

3.多采用亲水性材料

层析膜

1.固定T线及C线包被的抗体,并保证其生物学活性

2.待测样本在膜上毛细流动,并流向反应区

  1. 蛋白吸附能力强

  2. 孔隙度和湿润性适中

吸收垫1.吸收反应剩余的样本

1.强吸水能力和大吸水体积的亲水材料

底板
  1. 支撑层析膜,并和卡板粘合在一起

  2. 避免胶水影响膜的性能

1.选取机械强度比较高的材质

5、胶体金技术简介

胶体金是一种常用的标记技术,是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术,有其*的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都得到了广泛的应用。

胶体金也称金溶胶,是金盐被还原成子金后形成的金颗粒悬液,胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、鞣酸等作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。

胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子结合,如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。


6、胶体金常用检测技术

6.1、快速胶体金免疫渗滤法(80年代)

主要由两部分组成:膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒,其中填满吸水性物质,面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜,标记结合物为免疫金。

6.2、胶体金免疫层析法(90年代)

免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流)向另一端移动。移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化,无关物质则越过该区域而被分离,然后通过标记物显色来判定试验结果。

6.3、免疫胶体金光镜染色法

细胞悬液涂片或组织切片,可用胶体金标记的抗体进行染色,也可在胶体金标记的基础上,以银显影液增强标记,使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面,可明显增强胶体金标记的敏感性。

6.4、免疫胶体金电镜染色法

可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合,然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。

6.5、快速金标试剂技术

是将特异的抗体先固定于酸类纤维素膜的某一区带,当该干燥的酸类纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后,由于毛细管作用,样品将沿着该膜向前移动,当移动至固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合。同时利用金粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处。当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色的斑点。既为快速的金标检测方法原理。生产快速而精确试剂,要点在于所采用的单克隆抗体、多元克隆抗体、抗原、半抗原、蛋白嵌合物及胶体金等原料的灵敏性及特异性等是否能达到最高的标准,此为金标试剂的质量之重要的标准。

目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA),用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链DNA抗体等,具有简单、快速、准确和无污染等优点。


7、胶体金免疫渗滤技术

技术原理:胶体金免疫渗滤技术也采用胶体金作为示踪物,基于抗原和抗体结合的原理,不同之处在于渗滤技术层析方向是垂直的。

8、胶体金免疫层析技术

8.1、胶体金免疫层析技术也是胶体金免疫色谱技术,是20世纪80-90年代,在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一种新型的体外诊断技术,英文全称Colloidal Gold Immunochromatoaraphy Assay,缩写GICA。

8.2、胶体金免疫层析技术发展历程

1971年,Faulk和Taylor发明了胶体金标记蛋白质的方法,应用于免疫组化;

1973年,Frens G发明了柠檬酸钠还原氯金酸制备胶体金的方法;

1984年,第一次用胶体金在NC膜上实现了抗原的可视化检测;

20世纪80年代后期,第一次用胶体金在NC膜上实现了抗原的可视化检测。

8.3、胶体金免疫层析技术有三种反应模式:双抗体夹心法、间接法、竞争抑制法。

双抗体夹心法:双抗体夹心法主要用于大分子量蛋白(抗原)的检测。要求两株抗体针对一个抗原的不同位点才可以,例如FABP、cTnI、CK-MB等检测项目。也有个别项目是双抗原夹心检测抗体的,原理类似。

间接法:间接法主要用于血清中抗体检测,纯化或者重组的抗原固定于NC膜上,标记大多为蛋白A,例如HIV、人狂犬病毒IgG检测试剂盒(胶体金法)等。间接法要求金标蛋白过量,一般来说样品在加入之前需要稀释。胶体金免疫渗滤技术一般使用的就是间接法。

竞争法:竞争法主要用于小分子抗原(d品、农药、肽链)的检测。由于小分子抗原不能直接固定于NC膜上,常常用化学方法把小分子偶联到BSA等大分子物质上再固定于NC膜上。此结果判读方法与夹心法和间接法相反,阳性是只有C线显现,阴性是CT线都有。

9、基于显色原理的层析技术

10、分子发光原理

S0:基态;S1:第一电子激发单重态;S2:第二电子激发单重态;T1:第一电子激发三重态;T2:第二电子激发三重态。

室温下,大多数分子处于基态的低振动能级。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态,激发态不稳定,返回基态时伴随着光子的辐射,此即为“发光"。

由激发单重态低振动能级跃迁回基态,并伴随光子的辐射,称为“荧光发射";

由激发三重态低振动能级跃迁回基态,并伴随着光子的辐射,称为“磷光发光"。


11、荧光免疫层析简介

反应原理:免疫层析;

标记物:荧光物质;

检测对象:T线及C线荧光强度。

荧光物质的要求:

荧光信号强度高,摩尔消光系数大;

斯托克斯位移大;

激发光谱宽,发射光谱窄;

荧光寿命长,荧光信号稳定。


12、磁免疫层析技术简介

磁性免疫层析,指的是利用超顺磁性纳米微球代替胶体金等常规材料构建的一种基于免疫层析的试纸条,并利用磁信号检测仪对样品进行定量检测的方法。

优势:

生物样本中没有磁性材料,没有本底干扰;

磁信号可以传过NC膜,可以检测整个条带的磁信号。


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